在動物養殖的過程中難免 會遇到一些動物疾病，養牛過程中牛也會有各種各樣的問題，牛病毒性腹瀉也是很嚴重的一種傳染病，在發現的初期就要進行合理的治療，不然會帶來很大的損失。本文是一篇畜牧養殖論文范文，主要論述了牛病毒性腹瀉病毒山東株的分離與鑒定。

　　摘要：牛病毒性腹瀉病毒是牛病毒性腹瀉-黏膜病的重要病原體，該病毒病是極為復雜、呈多臨床類型表現的傳染病，給世界養牛業造成了巨大的經濟損失。本研究從疑似牛病毒性腹瀉-黏膜病的糞便中分離得到一株病毒能使MDBK細胞產生細胞病變，經RT-PCR檢測及擴增產物測序進一步證實，該病毒為牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒，TCID50測定該病毒的滴度為107.15TCID50/ml。該病毒株的分離鑒定為牛病毒性腹瀉病毒疫苗的研制奠定了基礎。

　　關鍵詞：牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒,分離,鑒定

　　牛病毒性腹瀉-黏膜病 (Bovine Viral Diarrhea-Mucosal Disease，BVD-MD) 是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine Viral Diarrhea virus，BVDV)感染而引起的一種重要傳染病，臨床上以發熱、腹瀉、黏膜糜爛、潰瘍、白細胞減少、持續感染與免疫耐受、免疫抑制、懷孕母牛流產、產死胎和畸型胎以及致死性黏膜病為主要特征[1，2]。該病呈世界性分布，廣泛存在于美國、澳大利亞、英國、新西蘭、匈牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度等國家[3]。BVDV不僅可感染牛，也能感染綿羊、山羊、豬、鹿和其它反芻動物。1946年美國人Olafson等首次發現并分離出BVDV，1983年我國李佑民等首次從流產胎兒的脾臟中分離到BVDV。BVDV屬于黃病毒科(Flaviviridae)，瘟病毒屬(Pestivirus)，與豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)和綿羊邊界病毒(Border Disease Virus，BDV) 同屬，存在抗原相關性，在血清學上存在著交叉反應，而且能夠突破宿主特異性發生交叉感染[4]。根據BVDV病毒基因組5′端非翻譯區(5′NTR)序列比較，把BVDV分為牛病毒性腹瀉病毒Ⅰ型(BVDV-Ⅰ)和牛病毒性腹瀉病毒Ⅱ型(BVDV-Ⅱ)[5，6]。根據BVDV可否使體外培養的傳代上皮細胞發生病變效應，可分為兩個生物型(biotype)：致細胞病變型(cytopathic，CP)和非致細胞病變型(noncytopathic，NCP)[7]。兩種生物型的病毒雖然與宿主細胞的作用不同，但BVDV只有一種血清型。BVDV感染情況復雜，持續性感染個體癥狀隱蔽。動物帶毒率高，特別是BVDV嚴重影響感染動物的繁殖，因此給全球畜牧業造成了巨大的經濟損失[8]。因而被世界動物衛生組織(OIE)列為發病必須上報的動物傳染病之一。本研究采集山東省某牛場發生嚴重腹瀉癥狀的病牛的糞便，并對其進行了分離和鑒定，BVDV山東株的獲得為BVDV疫苗的研究奠定了基礎。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　牛腎細胞(MDBK )由山東省農業科學院奶牛研究中心實驗室保存;DNA Marker DL2000 購于上海生工生物工程技術服務有限公司;DMEM細胞培養基、新生馬血清、胰蛋白酶為HyClone公司生產;MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit，TaKaRa pimeScriptTM RT-PCR Kit，LA Taq酶，dNTP， RNA酶抑制劑，均購于寶生物工程(大連) 有限公司。病料樣品為山東省某牛場發生嚴重腹瀉癥狀的病牛的糞便。

　　1.2病毒培養

　　1.2.1病料的處理取腹瀉奶牛糞便，用PBS(含10% 雙抗) 1∶5 稀釋。3 000 r/min 離心10 min，得到的上清液經0.22 μm 濾膜過濾除菌后得到病料處理液。

　　1.2.2病毒的接種選擇生長旺盛的MDBK單層細胞，棄去營養液。按細胞培養瓶1%的量接種病料處理液后37℃感作1 h，棄去感作液，加入維持液(2%新生馬血清的DMEM)于5%CO2、37℃培養。12 h觀察細胞病變，培養24 h后收毒。細胞毒反復凍融3次后再次接種MDBK 細胞，如此傳3代，收獲的細胞毒用于其它試驗。

　　1.3RT-PCR 鑒定及序列測定分析

　　1.3.1引物的設計合成根據已發表的BVDV NADL 株、Osloss 株、Orengon C24 等毒株的全序列的5′UTR保守區設計BVDV檢測引物及分型引物[9，10]，引物序列信息見表1，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。稀釋成20 μmol/L，-20℃保存。

　　畜牧養殖論文發表期刊推薦中國畜牧雜志于1953年創刊，由中國畜牧獸醫學會主辦，掛靠于中國農業大學動物科技學院。半個世紀以來，作為中央級唯一綜合性畜牧科技刊物和中文核心期刊之一，倍受廣大讀者和作者的信賴和關心，已擁有一個穩定的讀者群。