巨噬細(xì)胞是一種位于組織內(nèi)的白血球，源自單核細(xì)胞，而單核細(xì)胞又來(lái)源于骨髓中的前體細(xì)胞。有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。本文是一篇研究生論文發(fā)表范文，主要論述了奶牛腹腔巨噬細(xì)胞的分離與鑒定。

　　摘要：以無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液灌洗奶牛腹腔，分離獲取奶牛腹腔巨噬細(xì)胞，在含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并通過(guò)瑞氏染色計(jì)算其純度。結(jié)果表明，采用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液灌洗奶牛腹腔，能夠獲得較高純度的巨噬細(xì)胞，能為奶牛胞內(nèi)寄生菌存活機(jī)制的研究提供很好的試驗(yàn)材料。

　　關(guān)鍵詞：奶牛,巨噬細(xì)胞,分離培養(yǎng)

　　巨噬細(xì)胞(Macrophage)為免疫活性細(xì)胞，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞，在機(jī)體固有和適應(yīng)性免疫功能中扮演著極其重要的角色，可作為抗原呈遞細(xì)胞在誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其產(chǎn)生的可溶性細(xì)胞活素類因子參與調(diào)節(jié)特異性免疫反應(yīng)。巨噬細(xì)胞也是各類病原的靶細(xì)胞[1]，包括分支桿菌、沙門氏菌、衣原體等。

　　腹腔巨噬細(xì)胞是腹腔抗感染的第一道防線，是研究機(jī)體自然免疫和獲得性免疫關(guān)系的重要研究材料。但是迄今為止的報(bào)道多為有關(guān)小動(dòng)物如大鼠、豚鼠、小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞的分離鑒定，綿羊[2]、豬[3]、牛[4]等大家畜也有肺泡巨噬細(xì)胞分離的報(bào)道，尚未見(jiàn)有關(guān)奶牛腹腔巨噬細(xì)胞分離鑒定的方法。因此，本研究擬運(yùn)用RPMI-1640培養(yǎng)液灌洗奶牛腹腔的方法，獲得高純度、高活性的腹腔巨噬細(xì)胞并進(jìn)行相關(guān)鑒定，為下一步構(gòu)建奶牛巨噬細(xì)胞噬菌體文庫(kù)和以巨噬細(xì)胞為模型研究奶牛免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

　　1材料與方法

　　1.1主要試劑和儀器

　　RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone，小牛血清購(gòu)自天津?yàn)�洋生物工程公司，酸性磷酸酶染液�?alpha;-醋酸萘酚酯酶染液，HE染液試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司，瑞氏-姬姆薩染色液購(gòu)自濟(jì)南百博生物技術(shù)有限公司;儀器主要有CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡。

　　1.2奶牛腹腔巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)

　　購(gòu)15日齡雄性奶牛1只，平躺保定，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液500 ml，輕柔奶牛腹部3～5 min，靜置7～10 min后，用50 ml注射器抽取腹腔液。離心5 min(1 000 r/min)，棄上清，用PBS洗滌3遍，再用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×106個(gè)/ml，接種于培養(yǎng)瓶及6孔培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，棄上清液，用不含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液漂洗2遍，然后加入含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，并作相關(guān)染色和鑒定。

　　1.3培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

　　體外培養(yǎng)6 h后，將培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞形態(tài);取已鋪滿細(xì)胞的爬片，晾干后進(jìn)行姬姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

　　1.4奶牛腹腔巨噬細(xì)胞HE染色

　　取出細(xì)胞爬片，固定晾干，按照說(shuō)明進(jìn)行染色。

　　1.5奶牛腹腔巨噬細(xì)胞酶化學(xué)測(cè)定

　　1.5.1酸性磷酸酶染色(CACP) 取出細(xì)胞爬片，固定，晾干，按照說(shuō)明進(jìn)行染色。每片計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，共觀察5片，計(jì)算陽(yáng)性率(胞漿內(nèi)有棕紅色顆粒沉淀物為陽(yáng)性，胞漿內(nèi)粉紅色為陰性)。

　　1.5.2非特異性酯酶染色 取出細(xì)胞爬片，固定，晾干，放入含10%α-醋酸萘酯的基質(zhì)液(pH=6.3)中孵育1 h，流水沖洗3 min，晾干。甲基綠復(fù)染3 min，流水沖洗，晾干鏡檢。每片計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，共觀察5片，并計(jì)算陽(yáng)性率(胞質(zhì)內(nèi)有灰黑色沉淀物為陽(yáng)性，胞質(zhì)內(nèi)無(wú)沉淀物為陰性。

　　研究生論文發(fā)表期刊推薦中國(guó)畜牧雜志于1953年創(chuàng)刊，由中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)主辦，掛靠于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院。半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，作為中央級(jí)唯一綜合性畜牧科技刊物和中文核心期刊之一，倍受廣大讀者和作者的信賴和關(guān)心，已擁有一個(gè)穩(wěn)定的讀者群。