帕金森病（Parkinson′sdisease，PD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理特征為黑質(zhì)和紋狀體多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元變性缺失、紋狀體DA含量顯著減少[1]。目前臨床上常用左旋多巴類(lèi)藥物治療PD，該類(lèi)藥物只能改善PD的臨床癥狀，無(wú)法從根本上控制和阻斷PD的進(jìn)程。并且隨著病程不斷增長(zhǎng)和用藥量的加大，所顯現(xiàn)出來(lái)的副作用也越來(lái)越明顯。因此，尋找療效確切且副作用小的藥物成為研究PD藥物的熱點(diǎn)。

　　[摘要]目的：探討蓽茇總生物堿（PLA）對(duì)6-羥基多巴胺（6-OHDA）致帕金森病（PD）大鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。方法：采用腦立體定位單側(cè)紋狀體注射6-OHDA建立大鼠PD模型，將PD大鼠隨機(jī)分為PLA組（PLA50mg・kg-1・d-1），美多巴組（美多巴50mg・kg-1・d-1）及模型組，每組15只，每日灌胃給藥1次，連續(xù)6周。另隨機(jī)選取15只大鼠在紋狀體僅注射生理鹽水作為假手術(shù)組。采用阿樸嗎啡（APO）誘導(dǎo)的大鼠旋轉(zhuǎn)及轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)觀察，酪氨酸羥化酶（TH）免疫組化檢測(cè)大鼠黑質(zhì)中TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及紋狀體中TH陽(yáng)性纖維密度，用分光光度法檢測(cè)大鼠黑質(zhì)及紋狀體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、還原型谷胱甘肽（GSH）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（NOS）的含量。結(jié)果：帕金森病大鼠在APO誘導(dǎo)后出現(xiàn)明顯的旋轉(zhuǎn)行為，且在轉(zhuǎn)棒上的滯留時(shí)間縮短，黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及紋狀體TH陽(yáng)性纖維密度明顯減少，組織內(nèi)SOD，GSH-Px，CAT的活力降低，NOS的活力升高，MDA，NO含量升高，GSH含量降低，總抗氧化能力明顯降低。PLA能明顯改善PD大鼠的行為學(xué)異常，增加黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及紋狀體TH陽(yáng)性纖維密度，提高組織內(nèi)SOD，GSH-Px，CAT的活力，降低NOS的活力，降低MDA和NO含量，提高GSH含量，總抗氧化能力明顯提高。結(jié)論：蓽茇總生物堿對(duì)6-OHDA致PD模型大鼠的黑質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗氧化活性有關(guān)。

　　[關(guān)鍵詞]浙江中醫(yī)雜志,帕金森病,蓽茇,生物堿,6-羥基多巴胺,抗氧化

　　蓽茇PiperlongumL.是中蒙藏維醫(yī)習(xí)用藥材，具有溫中散寒，行氣止痛等功效，在印度也廣泛應(yīng)用[2]。蓽茇中含有較豐富的酰胺類(lèi)生物堿，并且具有抗炎、抗氧化、抗乙肝病毒和免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理活性[3-4]。近年來(lái)的研究表明，蓽茇中含量最高的胡椒堿具有很強(qiáng)的抗氧化作用，可以通過(guò)抑制線(xiàn)粒體膜通透性的改變減少M(fèi)PP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的凋亡[5]，并且對(duì)6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導(dǎo)的PD大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，推測(cè)可能是通過(guò)抗凋亡和抗炎機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[6]。本課題組在前期研究工作中，已建立了蓽茇總生物堿（PLA）有效部位提取制備的穩(wěn)定工藝[7]，并對(duì)蓽茇總生物堿的化學(xué)成分及其在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布進(jìn)行了研究[8-10]，為蓽茇總生物堿的藥效研究奠定了基礎(chǔ)。本研究以6-OHDA單側(cè)損傷紋狀體制備PD大鼠模型，探討蓽茇總生物堿對(duì)損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用及其對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，為開(kāi)發(fā)蓽茇防治帕金森病提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1試劑6-羥基多巴胺（6-OHDA，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)MKBH3054）；阿樸嗎啡（apomorphine，APO，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)SLBB0077V）；美多巴（上海羅氏有限公司，批號(hào)SH1001）；酪氨酸羥化酶單克隆抗體（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)101M4796）；鼠ABC檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Vector公司，批號(hào)172013）；濃縮型DAB試劑盒（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)K133319D）；總蛋白定量測(cè)試盒（批號(hào)20130216），超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒（批號(hào)20130614），丙二醛（MDA）測(cè)試盒（批號(hào)20121120），還原型谷胱甘肽（GSH）測(cè)試盒（批號(hào)20130228），谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶（GSH-Px）測(cè)試盒（批號(hào)20121122），一氧化氮（NO）測(cè)試盒（批號(hào)20130426），一氧化氮合酶（NOS）測(cè)試盒（批號(hào)20130223）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

　　1.2儀器Stoelting腦立體定位儀（美國(guó)Stoelting公司）；大鼠旋轉(zhuǎn)行為記錄儀（美國(guó)ColumbusInstruments公司）；大鼠疲勞轉(zhuǎn)棒儀（西班牙Panlab公司）；CM3050S冰凍切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；ECLIPSE80i型顯微鏡（日本Nikon公司）；SIGMA-3K15冷凍離心機(jī)（德國(guó)SIGMA公司）；SPECTRAmaxPLUS384連續(xù)光譜酶標(biāo)儀（美國(guó)分子儀器公司）。

　　1.3蓽茇總生物堿的制備蓽茇藥材購(gòu)于新疆維吾爾醫(yī)院藥房（批號(hào)PLL-10-09），由新疆藥物研究所劉慶華研究員鑒定為胡椒科胡椒屬植物蓽茇P.longum的未成熟的果穗。稱(chēng)取干燥粉碎的蓽茇果穗3kg，加入85%乙醇15L加熱回流提取，提取液過(guò)濾后合并濾液，回收乙醇得到蓽茇提取物。蓽茇提取物溶于水后經(jīng)大孔樹(shù)脂采用0%，20%，40%，60%，85%的乙醇水溶液梯度洗脫，將60%乙醇洗脫流分合并后回收乙醇，減壓干燥得到蓽茇總生物堿有效部位，紫外分光光度法測(cè)定其總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為64.43%。HPLC檢測(cè)其胡椒堿、蓽茇明寧堿和二氫蓽茇明寧堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50.68%，3.74%，0.62%。

　　1.4動(dòng)物分組及處理雄性SD大鼠120只，SPF級(jí)，體重220～240g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）2012-0001。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7d。造模成功后隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組、PLA組、美多巴組，每組15只。模型篩選24h后開(kāi)始灌胃給藥，PLA組給予蓽茇總生物堿50mg・kg-1・d-1，美多巴組給予美多巴50mg・kg-1・d-1，模型組、假手術(shù)組給予相同劑量的0.5%CMC-Na水溶液，連續(xù)給藥6周，每日1次。1.5PD大鼠模型的制作及篩選大鼠經(jīng)10%水合氯醛（3.5mL・kg-1）腹腔注射麻醉后，顱平位固定于大鼠腦立體定位儀上，頭部備皮消毒后，切開(kāi)頭部皮膚，充分暴露前囟。參照Paxinos等[11]的大鼠腦立體定位圖譜，確定左側(cè)紋狀體三坐標(biāo)點(diǎn)[12]：一點(diǎn)為前囟前0.7mm，矢狀線(xiàn)左側(cè)旁開(kāi)2.6mm，硬膜下6.0mm；一點(diǎn)為前囟前0.7mm，矢狀線(xiàn)左側(cè)旁開(kāi)2.6mm，硬膜下5.5mm；另一點(diǎn)為前囟前0.7mm，矢狀線(xiàn)左側(cè)旁開(kāi)2.6mm，硬膜下5.0mm處。每點(diǎn)用微量注射器緩慢勻速（1.0μL・min-1）注入6-OHDA（4g・L-1，用含0.02%抗壞血酸的生理鹽水配制）1.0μL，注射完畢后留針5min，然后緩慢退針，縫合切口皮膚，外涂青霉素粉劑預(yù)防感染。假手術(shù)組用上述相同方法向左側(cè)紋狀體注射同體積的含0.02%抗壞血酸的生理鹽水。術(shù)后第5周，以皮下注射0.5mg・kg-1APO誘發(fā)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)[13]，先使大鼠適應(yīng)測(cè)試環(huán)境5min，再用計(jì)算機(jī)自動(dòng)測(cè)試系統(tǒng)記錄APO所誘發(fā)的大鼠旋轉(zhuǎn)行為，記錄開(kāi)始旋轉(zhuǎn)至30min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，以向左側(cè)（損傷側(cè)）旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與向右側(cè)（健側(cè)）旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的差值在30min內(nèi)的平均數(shù)為凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，且凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)>80r・h-1，則視為成功模型。

　　1.6行為學(xué)檢測(cè)分別于大鼠給藥后第3周和第6周以皮下注射APO0.5mg・kg-1誘發(fā)各組大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，記錄開(kāi)始旋轉(zhuǎn)至30min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。分別于給藥后第3，6周進(jìn)行大鼠轉(zhuǎn)棒行為觀察。測(cè)試前1周每天將大鼠在8r・min-1的轉(zhuǎn)速下訓(xùn)練3次，每次5min，2次訓(xùn)練之間間隔20min作為疲勞恢復(fù)時(shí)間。測(cè)試當(dāng)天，將大鼠放在轉(zhuǎn)棒上，啟動(dòng)轉(zhuǎn)棒，開(kāi)始計(jì)時(shí)，大鼠為保持平衡而跟隨轉(zhuǎn)棒運(yùn)動(dòng)，逐漸增加轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)速，觀察大鼠運(yùn)動(dòng)，直至大鼠從轉(zhuǎn)棒上掉落，結(jié)束計(jì)時(shí)。

　　1.7TH免疫組化染色各組大鼠麻醉后經(jīng)心臟灌流固定，斷頭取腦，經(jīng)冰凍切片，進(jìn)行免疫組化染色（ABC法）。切片入0.3%TritonX-100透膜30min；3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；正常羊血清封閉30min；TH一抗4℃孵育過(guò)夜；生物素標(biāo)記羊抗小鼠二抗，室溫孵育2h；辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫孵育30min，37℃孵育30min。以上各步驟均用0.01mol・L-1PBS洗5min×3。最后用DAB顯色。常規(guī)脫水、透明、封片。每只大鼠各取紋狀體、黑質(zhì)相同部位腦片3張，通過(guò)Nikon顯微鏡采集圖像，用NIS-Elements病理圖像分析系統(tǒng)（Ver.2.1）進(jìn)行分析，根據(jù)灰度值選取TH陽(yáng)性細(xì)胞和TH陽(yáng)性纖維，計(jì)算黑質(zhì)區(qū)域TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目和紋狀體區(qū)域TH陽(yáng)性纖維密度值。

　　1.8腦組織各生化指標(biāo)的測(cè)定大鼠斷頭后迅速取腦組織，分離雙側(cè)紋狀體及中腦腹側(cè)組織，準(zhǔn)確稱(chēng)取質(zhì)量，用0.9%的生理鹽水制成10%的組織勻漿，2500r・min-1離心取上清，分裝后置于-80℃凍存。采用生物化學(xué)法檢測(cè)SOD，CAT，GSH-Px，NOS活性以及MDA，GSH，NO含量。以上測(cè)定均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

　　1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，采用One-WayANOVA分析各組間差異，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2結(jié)果

　　2.1蓽茇總生物堿對(duì)APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為的影響術(shù)后5周，經(jīng)APO誘導(dǎo)后，假手術(shù)組大鼠無(wú)明顯旋轉(zhuǎn)現(xiàn)象，模型組大鼠存在異常旋轉(zhuǎn)行為，旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與假手術(shù)組相比明顯增多（P<0.05）。PLA組經(jīng)給藥治療3周后，大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與模型組相比明顯減少（P<0.05），見(jiàn)表1。

　　2.2蓽茇總生物堿對(duì)大鼠轉(zhuǎn)棒行為的影響術(shù)后5周，假手術(shù)組大鼠在轉(zhuǎn)棒上的滯留時(shí)間為（65.0±4.1）s，模型組大鼠平衡協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)功能較差，在轉(zhuǎn)棒上的滯留時(shí)間明顯比假手術(shù)組短（P<0.05）。PLA組經(jīng)給藥治療6周后，大鼠在轉(zhuǎn)棒上的滯留時(shí)間較模型組顯著增加（P<0.05），見(jiàn)表2。

　　2.3蓽茇總生物堿對(duì)PD大鼠腦組織內(nèi)TH表達(dá)的影響與假手術(shù)組相比，模型組黑質(zhì)部位TH陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少（P<0.05），紋狀體部位的TH陽(yáng)性纖維密度明顯降低（P<0.05）。經(jīng)給藥6周后，PLA及美多巴組與模型組相比，黑質(zhì)部位TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增加（P<0.05），紋狀體部位的TH陽(yáng)性纖維密度明顯升高（P<0.05），見(jiàn)表3。

　　2.4蓽茇總生物堿對(duì)PD大鼠腦組織內(nèi)SOD，GSH-Px，CAT，NOS活性和MDA，GSH，NO含量的影響與假手術(shù)組相比，模型組大鼠損傷側(cè)紋狀體和黑質(zhì)的SOD，CAT，GSH-Px活性明顯降低（P<0.05），NOS的表達(dá)增加（P<0.05），MDA和NO的含量升高（P<0.05），GSH的含量降低（P<0.05）。與模型組相比，經(jīng)灌胃給藥6周后，PLA組及美多巴組上述指標(biāo)均有明顯改善，大鼠黑質(zhì)及紋狀體內(nèi)的SOD，CAT，GSH-Px活性明顯增加（P<0.05），NOS的表達(dá)降低（P<0.05），MDA和NO的含量降低（P<0.05），GSH的含量增加（P<0.05），見(jiàn)表4，5。

　　3討論

　　帕金森病是一種多病因、多發(fā)病機(jī)制的老年退行性疾病，目前認(rèn)為PD的發(fā)病可能與氧化應(yīng)激、線(xiàn)粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的下調(diào)、蛋白質(zhì)異常折疊和集聚、鈣平衡紊亂等多種因素有關(guān)[14]。其中，氧化應(yīng)激是帕金森病發(fā)病的核心因素[15]，抗氧化治療成為治療帕金森病確實(shí)有效的方案之一[16]。蓽茇具有廣泛的藥理活性和較強(qiáng)的抗氧化能力[17]。鑒于PD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，而中藥有效部位的多成分具有協(xié)同作用和整體調(diào)節(jié)等優(yōu)勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)選擇含有多種酰胺類(lèi)生物堿的蓽茇總生物堿有效部位作為研究對(duì)象，考察其對(duì)6-OHDA致大鼠PD模型損傷的DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用，并從抗氧化作用來(lái)探討其可能的保護(hù)機(jī)制。在大鼠的行為學(xué)評(píng)價(jià)方面，通過(guò)外周給予DA受體激動(dòng)劑APO可誘發(fā)大鼠向健側(cè)產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)行為，記錄一定時(shí)間內(nèi)APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，可以對(duì)PD的損傷程度進(jìn)行量化，作為判斷模型成功與否以及藥物治療作用的標(biāo)準(zhǔn)[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用腦立體定位注射6-OHDA制備紋狀體單側(cè)毀損的PD大鼠，在APO誘導(dǎo)后出現(xiàn)明顯的旋轉(zhuǎn)行為，且在轉(zhuǎn)棒上的滯留時(shí)間縮短，該行為與大鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元的損傷以及紋狀體內(nèi)DA含量的減少程度有關(guān)[19]。通過(guò)TH免疫組化染色顯示了PD大鼠模型中腦黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞及紋狀體中TH陽(yáng)性纖維表達(dá)減少，證明6-OHDA單側(cè)紋狀體注射造成大鼠黑質(zhì)大量DA能神經(jīng)元脫失，因而經(jīng)黑質(zhì)-紋狀體通路投射到紋狀體的DA神經(jīng)遞質(zhì)減少。這一結(jié)果與行為學(xué)結(jié)果一致。PLA干預(yù)6周后，則能明顯改善PD大鼠的行為異常，增加黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及紋狀體TH陽(yáng)性纖維密度，從而推測(cè)PLA對(duì)DA神經(jīng)元具有一定保護(hù)作用。

　　研究表明氧化應(yīng)激和自由基損傷在PD的發(fā)病和發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，正常生物體內(nèi)存在著SOD，GSH-Px，CAT和GSH等抗氧化酶及非酶系統(tǒng)，在整個(gè)防御體制中，SOD歧化氧陰離子（O2-）為過(guò)氧化氫（H2O2），CAT催化分解H2O2為水（H2O）和氧（O2），GSH-Px利用GSH還原H2O2為H2O或醇類(lèi)化合物，它們相互協(xié)調(diào)，通過(guò)抗氧化以及清除多余的自由基對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用[20-21]。而6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，抗氧化保護(hù)系統(tǒng)SOD，GSH-Px，CAT和GSH等功能異常，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，氧自由基增多，引起過(guò)氧化脂質(zhì)產(chǎn)物MDA的含量明顯升高[22-23]。而NO作為氧自由基的一種，其神經(jīng)毒性在PD的發(fā)病中起著重要作用，在病理狀態(tài)下，NOS過(guò)量表達(dá)和NO含量升高，致使機(jī)體內(nèi)過(guò)氧亞硝基的生成增多，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠黑質(zhì)及紋狀體內(nèi)SOD，GSH-Px，CAT的活力降低，NOS的表達(dá)升高，MDA和NO含量升高，GSH的含量降低，說(shuō)明模型動(dòng)物的抗氧化能力降低。而PLA干預(yù)后，提高了大鼠黑質(zhì)及紋狀體內(nèi)的SOD，GSH-Px，CAT的活力，降低NOS的表達(dá)及MDA和NO的含量，升高GSH的含量，表明PLA能提高6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠抗氧化能力。

　　綜上所述，經(jīng)過(guò)蓽茇總生物堿治療后，PD大鼠的神經(jīng)元受損得到一定的修復(fù)，行為得到明顯改善，而機(jī)體抗氧化能力也明顯提高，說(shuō)明蓽茇總生物堿對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，并且這種保護(hù)作用可能與PLA的抗氧化作用有關(guān)。

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